<progress id="7pnp3"><font id="7pnp3"><cite id="7pnp3"></cite></font></progress>

    <address id="7pnp3"><font id="7pnp3"></font></address>

    <address id="7pnp3"><thead id="7pnp3"></thead></address><progress id="7pnp3"></progress><progress id="7pnp3"><menuitem id="7pnp3"></menuitem></progress>

    <big id="7pnp3"></big>

    <sub id="7pnp3"></sub>

    <meter id="7pnp3"><mark id="7pnp3"><mark id="7pnp3"></mark></mark></meter>

    | 項目咨詢 |積分體系 | 加入收藏 | 設為首頁 | RSS
    您當前的位置:首頁 > 醫藥

    2015年基因檢測行業一覽

    時間:2016-01-07 16:54:15  來源:  作者:
    更多

     繼上次基因檢測產業調研之后,這兩周我們再次調研了幾家基因檢測公司,并且拜訪了一些行業專家,現將調研的重點內容整理如下,歡迎大家交流探討。


     

    一、基因檢測公司梳理

     

    目前全國涉及基因檢測概念的公司有200余家,按照業務范圍劃分,這些公司可以分為:①最上游的基因檢測儀器開發企業(測序儀、芯片掃描儀、PCR設備),②提供樣本處理試劑和耗材的中上游企業(建庫試劑盒、檢測試劑盒、工具酶、基因芯片),③提供第三方基因檢測服務的中游企業,④提供測序數據存儲、分析和出具報告的下游企業,⑤還有將這三部分整合起來提供CRO服務的商業公司,當然如果公司研發實力和經濟實力允許,大部分公司會選擇向上下游產業鏈延伸,進一步提升自己的盈利能力。


     

    按照基因檢測公司的服務內容,主要可以分為四類:科研服務、第三方臨床基因檢測服務、直接面向個人的檢測服務、非醫療基因檢測服務(例如食品、環境、刑偵等方面的應用)。

    • 1 科研中的基因檢測服務又分為兩種情況,第一種是純科研服務,檢測目的純粹是滿足科研需要,不作為醫學診斷的依據;第二種是以科研的名義為患者提供醫學診斷服務,醫生在其中起主導作用,推薦有需要的患者去做基因檢測,醫生在其中所獲得的好處是得到用藥指導依據、科研數據、獲得銷售提成,這是當前腫瘤基因測序普遍采用的手段,因為目前國內還沒有一種獲批臨床的腫瘤高通量檢測試劑盒,只能以科研的形式變相的進行醫學診斷從而獲取收益。純科研基因檢測市場在百億級別。

    •  

    •  

    •  

    •  

    • 2 第三方臨床檢測機構是指批準為醫院提供檢測外包服務的獨立醫學檢驗實驗室,大部分第三方臨檢機構都能開展分子診斷服務(需通過臨檢中心的PCR實驗室認證),例如QPCR、ddPCR、基因芯片等,但是高通量測序在臨床檢測上的應用當前受到限制,只有在試點名單上的機構才能出具正式的臨檢報告,目前出臺了第一批四個領域的試點名單,分別是遺傳病診斷、產前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷、腫瘤基因測序,試點單位名單由衛計委醫政醫管局和婦幼司共同制定。臨床基因檢測的市場空間在千億級別。

    •  

    •  

    •  

    •  

    • 3 提供面向個人基因檢測服務的商業公司,提供的是非診斷性基因檢測,例如23andMe是美國本地唯一一家被FDA批準的能夠直接向個人提供基于基因檢測分析服務公司,業務范圍也僅僅提供祖源分析、遺傳病篩查、酒精耐受、基因尋親這四類遺傳分析服務,23andMe此前的疾病風險篩查和藥物過敏分析被禁止,而我國有許多直接面向個人的基因檢測商業機構,業務范圍甚至包括疾病風險、天賦基因、個性特征分析等一系列基因分析服務,未來有加強監管和整合的壓力。商業化B2C基因檢測的市場空間在十億級別。

    •  

    •  

    • 4 非醫療基因檢測服務的應用包括食品、環境微生物、刑偵檢測、檢驗檢疫等方面,主要由非醫學的商業檢測中心來開展,主要采用的技術是熒光定量PCR、基因芯片,測序技術用得較少。例如中德美聯是法醫DNA檢測領域的龍頭,主要采用熒光PCR技術,法醫DNA檢測的市場空間在20億左右,但是全國共有700多個司法檢測實驗室,有一定的整合難度。整體來看非醫療基因檢測服務是碎片化市場,涉及領域多,空間在百億級別。


     

    當然我們重點關注的還是基因檢測在醫學診斷上的運用,這個領域受眾廣,附加值高,市場空間大。

     


    二、基因檢測行業到底如何監管?

    我國基因產業處在市場興起的初期階段,監管制度還十分不完善,給人的感覺十分混亂。2014年以前,我國基因測序行業處于無監管狀態;2014年2月,CFDA和衛計委叫停所有基因測序業務,對行業進行集中整頓;2014年3月,衛計委發布《關于開展高通量基因檢測技術臨床應用試點單位申報工作的通知》,通知要求已經開展高通量基因測序技術,且符合申報規定條件的醫療機構可以申請試點,同時明確申請試點的基因測序項目。2014年12月,衛計委醫政醫管局發布遺傳病診斷、產前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷這三個專業的第一批基因測序臨床試點名單;隨后2015年1月,衛計委婦幼司正式批準108家醫療服務機構開展NIPT高通量測序技術臨床試點,并審核通過13家機構開展植入前胚胎遺傳學診斷臨床試點;2015年3月,醫政醫管局發布了第一批腫瘤診斷與治療項目高通量測序臨床試點名單。此后CFDA批準了幾款用于高通量測序的儀器、檢測試劑等。那么基因檢測產業到底由誰監管,怎么監管,監管的范圍是什么?我們做了以下梳理。


     

    監管部門:整個基因檢測行業涉及細分產業眾多,包括醫院、臨檢中心、儀器試劑、商業公司、不同的技術平臺等,所以涉及的監管部門也較多。①發改委,從宏觀上制定基因檢測產業的發展規劃:2015年6月,發改委發布《國家發展改革委關于實施新興產業重大工程包的通知》,其中提到要重點發展基因檢測等新型醫療技術,并將在3年時間內建設30個基因檢測技術應用示范中心,快速推進基因檢測臨床應用以及基因檢測儀器試劑的國產化;此外地方發改委還參與基因檢測項目的定價,例如四川發改委定價無創產前2400元/次。衛計委主要是對開展基因檢測機構的資質進行審查和規范,具體由三個部分監管,分別是醫政醫改局、婦幼司、臨檢中心:醫政醫改局先后發布遺傳病診斷、產前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷、腫瘤診斷與治療這四個專業的第一批基因測序臨床試點名單,《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》,《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》等規范;婦幼司則針對產前檢測在醫政醫改局試點名單的基礎上增加了108家醫療服務機構開展NIPT高通量測序技術臨床試點,并審核通過13家機構開展植入前胚胎遺傳學診斷臨床試點;臨檢中心的職責是承擔臨床檢驗質量管理與控制工作,運行全國臨床檢驗室間質量評價計劃,建立、應用臨床檢驗參考系統,對開展基因檢測服務的醫學實驗室進行評估和驗收,例如。③CFDA,對基因檢測鏈上的儀器、試劑、分析軟件進行監管,例如EGFR、KRAS、BRAF、C-KIT、CYP2C9、CYP2C19等基因的檢測試劑盒、基因芯片等;在高通量測序方面,CFDA先后批準了幾款應用于NIPT的測序儀和檢測試劑,但是在腫瘤的診斷方面,目前還沒有高通量測序儀和高通量檢測試劑盒獲批,試點單位只能以自制試劑(LDTs)的形式開展檢測。


     

    技術的監管:基因檢測中的技術平臺主要有PCR(qPCR、ddPCR)、FISH(熒光原位雜交技術)、基因芯片、測序(一代測序、高通量測序),目前除高通量測序臨床服務制訂了限制政策,只有試點單位才能出具臨檢報告,其他基因檢測技術,如PCR、FISH、一代測序等的使用沒有限制,臨檢單位只要通過了PCR實驗室、病理學實驗室認證就可以應用這些技術。


     

    機構的監管:什么樣的機構能夠開展高通量測序臨床服務?除了醫政醫改局和婦幼司發布的試點高通量基因測序技術臨床試點單位名單外,還有衛計委批準的“個體化醫學檢測試點單位(業內常簡稱為LDT試點),首批試點單位包括中南大學湘雅醫學檢驗所、北京博奧醫學檢驗所和中國醫科大學第一附屬醫院這3家機構,個體化醫學檢測試點的廣度和范疇,要高于高通量基因測序試點;此外還有一些地方衛生部門所批準成立的檢驗所,例如“南京高新精準醫學檢驗所”。但是即使沒有這些資質,測序服務機構也能以科研報告的形式提供檢測服務(規避醫學檢驗的限制),或者與試點醫院成立聯合實驗室,享受利潤分成。這些都折射出當前我國基因行業監管的不成熟,美國臨檢機構采取的是CLIA/CAP認證的形式,很大可能我國未來也會采取類似的認證資質。


     

    應用領域的監管:目前高通量測序臨床上的應用還只能試點應用于遺傳病診斷、產前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷和腫瘤診斷與治療四個專業方向。但是在心血管領域、感染性疾病、腸道微生物宏基因組學等領域,二代測序都有良好的應用前景,當前的臨床高通量測序試點只是LDT試點在某個專業方向的具體應用,未來應用領域會越來越廣。


     

    儀器試劑的監管:由CFDA進行審批,高通量測序中需要申報的有測序儀(綁定上機試劑)、建庫試劑盒、檢測試劑盒、分析軟件等。NIPT方面,CFDA先后批準了華大基因(BGISEQ-100基于life的Ion Torrent技術、BGISEQ-1000基于華大基因之前收購的Complete Genomics的測序技術)、達安基因(DA Proton基于life的Ion Torrent技術)、博奧生物(BioelectronSeq 4000基于life的Ion Torrent技術)、貝瑞和康(與Illumina合作的NextSeq CN500)的NIPT二代基因測序儀和配套試劑(13、18、21號染色體三體檢測試劑盒、上機測序試劑);在腫瘤方面,目前目前還沒有高通量測序儀和高通量檢測試劑盒獲批,試點單位只能以自制試劑(LDTs)的形式開展檢測服務。從長遠來看,多目標基因panel(幾十上百個基因或靶點)高通量檢測試劑盒基本沒有獲批的可能,因為位點突變率很低,很難找到足夠的病人開展臨床試驗,并且檢測結果也無法去驗證,所以這類試劑盒只能以LTDs的形式在臨檢實驗室使用,無法外售;而少量目標基因(數個基因,少量突變位點)的檢測試劑盒可能會被CFDA審批,但是從檢測成本來說,少量目標基因的檢測成本不會比多目標基因檢測低,所以終端價格相差不大,當與多目標基因panel一起進行市場推廣的時候,并不具有優勢。


     

    總結:當前國內高通量測序在臨床上的應用監管還很不成熟,試點名單是名義上具有出具臨床檢驗報告資質的機構,并不是其他機構開展測序服務的限制條件(能以科研的形式開展服務),儀器、試劑的審批也不具備限制性,市場處于洗牌階段,基因檢測公司需要積極進行兩手準備,一方面籌備臨檢資質的申報,積極布局醫院終端,一方面著手儀器、試劑的審批。我國未來可能采取和美國類似的CLIA/CAP審批,優先布局醫院渠道的有望受益。


     

    案例(美國CLIA認證):在美國,只要通過了CLIA(Clinical Laboratory Improvement Amendments,臨床實驗室改進法案)認證,第三方實驗室就可以根據市場需求,開發出各種新的診斷試劑或服務,即自建項目或者自制試劑(LDTs)。這種檢測只能在該實驗室內使用,不能外傳或者出售給其他任何實驗室或者醫療保健機構,從而將風險控制在有限的范圍,因而不需要FDA的批準。同時,由于CLIA認證的是實驗室,所以并不需要對每個新服務或產品作出審批申請。醫院或者病人可以根據自己的需要,選擇相應的診斷項目。這個政策給了第三方實驗室極大的自由空間,也帶來了美國獨立實驗室的繁榮發展。CLIA 認證最獨特的地方在于,實驗室自建項目即使在沒有FDA批準的情況下,也完全可以在其實驗室范圍內提供分子檢測業務來指導臨床。只要是有CLIA執照的實驗室,他們自己研發的制劑、技術等也可以合法地進入臨床,合理收費。這樣做的好處就是:在巨大的醫療需求、和日新月異的新技術面前,所有的CLIA實驗室可以跟據市場需求,快速地開發出各種新的診斷應用。同時,美國政府不必對應接不暇的每個新應用做出回應。而病人可以根據自己的需要,即時得到新的診斷服務。同時FDA可以選擇FDA認為真正好的診斷方法做進一步認證,并以FDA的名義發布認證,以加速FDA認為好的診斷方法在市場上的應用。申報企業只要通過了CLIA認證,并能保證產品的質量,那么就可以直接應用于臨床上。

     


    三、基因測序重在服務

     

    基因測序重在服務,很難單獨依靠商品(檢測試劑盒、芯片)來建立優勢,這與免疫診斷、化學發光有所不同,因為基因檢測歸根結底都是DNA一級序列的檢測,與二級、三級結構無關,檢測原理相對簡單,都是通過DNA引物靶定待測序列,然后通過引物延伸來實現序列的測定;相反,樣品DNA的提取、建庫和捕獲的操作倒是比較繁瑣,需要專業的技術人員去操作。上游儀器已然被少數幾個公司所壟斷,中上游的試劑盒產品并不具有很高的技術壁壘(當然如果能在建庫環節和捕獲環節形成明顯技術優勢,或者是開發出效率更高的工具酶,也是很有發展前景的),而且高通量基因檢測試劑盒的審批存在較大的不確定性(未來可能參照美國CLIA認證的方式,具有資質的檢測機構以LTDs自制試劑的形式使用,但是不通過藥監局的審批就無法對外銷售),醫院樣本量有限,先進入的肯定會占據諸多優勢,NIPT市場已經接近飽和,腫瘤醫院的爭奪也日趨白熱化,所以率先通過服務來搶占市場,這或許是較為穩妥的選擇。


     

    醫院是否會自行購置測序儀開展高通量測序?如果醫院自己測序,那么臨檢測序機構勢必難以競爭,所以思考這個因素是有必要的。這個問題要分開來看,一方面考慮用戶的數量和需求,一方面考慮測序成本。以當前高通量測序用的最廣泛的是NIPT和腫瘤診治為例進行分析


     

    在無創產前診斷領域,我國每年的新生兒在1500萬人左右,潛在客戶基數大,NIPT能夠給出明確的診斷結果和對應的防治措施,而且結果關系到下一代的健康,檢測價格在2400元左右,受眾廣泛;此外,NIPT對測序的精度要求不是特別高(目前主要是針對13、18、21號染色體的三體檢查),檢測是一個定量的過程,通常采用life ion torrent平臺(目前獲批的5款儀器里面3家申報的是ion torrent,而且美國已經有機構采用基因芯片來做NIPT),很多大型醫院能夠自行開展NIPT服務,第三方測序機構的目標市場應該在中小型醫院。


    但是高通量測序在腫瘤領域的應用就不太一樣,我國每年新增腫瘤患者在450萬人左右,腫瘤panel測序的價格在8千到2萬之間,而且現在做腫瘤panel測序的患者主要目的是獲得靶向藥物用藥指導,靶向藥物價格比較昂貴(每個月的用藥開銷在5萬左右),所以目標人群就更加狹窄了;此外,腫瘤檢測對測序精度要求比較高,主要針對點突變或者微缺失微重復,對技術平臺的要求高,通常采用Illumina Hiseq/next Seq測序儀,儀器設備昂貴,并且開機試劑耗材的花費高(一次開機在15萬左右),如果沒有足夠的樣本量,基本上每次開機都是虧損;并且腫瘤數據的分析比較復雜,需要專門的生物信息學人才和數據庫,所以在腫瘤領域(在其他病患更少的領域更是如此),我們認為高通量測序還是以第三方臨檢機構為主,目標市場在大型醫院。

     


    四、液態活檢技術(ctDNA、CTC、外泌體)

    要弄清楚液態活檢(Liquid Biopsy)是什么,可以先了解一下什么是活檢。“活檢”即活體組織檢查,是指從患者體內切取、鉗取或穿刺等取出病變組織,進行病理學檢查的技術。這是診斷病理學中最重要的部分,對絕大多數送檢病例都能做出明確的組織病理學診斷,被作為臨床的最后診斷。普通的活檢通常要經過手術或者穿刺來獲得組織樣本,而且有時候需要反復多次的進行取樣,不僅繁瑣,給患者增加痛苦,而且有時候取樣不準確,例如穿刺有時取到正常組織。而液態活檢是對患者血液中的游離的標志物進行檢查,不僅取樣更加方便,而且能夠在疾病的更早期獲得檢測結果。

     

    液體活檢對于我們來說其實并不陌生,例如目前已經較為成熟的NIPT就是液體活檢技術,以前要對胎兒進行檢測要進行“羊水穿刺”,這會造成一定的流產風險,而NIPT就是對母體外周血中游離的胎兒DNA進行檢測,從而實現了無創檢測。液態活檢的另外一大應用是癌癥領域,常規組織活檢在癌癥診治中有一定的局限性:第一,癌癥有異質性,對于已經發生轉移的癌癥患者而言,僅僅取某個部位的癌組織,并不能反映患者整體的情況,但是,對所有的癌組織都取樣又不好操作;第二,有些患者自身的情況決定了他不適合組織活檢;第三,有些腫瘤在受到手術的擾動之后,有加速轉移的風險;第四,即使所有的條件都適宜,組織活檢的滯后性對患者的治療也是不利的。


    癌癥液態活檢的標志物主要有三種:ctDNA、CTC、外泌體。

    1.jpg

    1.jpg

     

    4.1 看好ctDNA檢測

     

    ctDNA(circulating tumor DNA)即循環腫瘤DNA,是人體血漿中游離的DNA (cell-free DNA,cfDNA)的一種,ctDNA是癌細胞死亡時產生的DNA碎片,攜帶了大量癌細胞的信息,因此通過分析血液ctDNA,可以了解患者癌細胞的突變情況。這些突變的信息能夠反映患者體內癌癥的進展情況,以及為患者選擇合適的治療藥物。

     

     

    ctDNA檢測的技術平臺:目前在ctDNA檢測領域潛力最大的技術平臺是第二代測序(NGS)和數字PCR(ddPCR),這兩個技術靈敏度較高,保證了檢出下限,ctDNA含量很低,大多低于cfDNA總量的1%,其他技術很難從正常組織DNA中檢測出異常的ctDNA。雖然目前也有研究用qPCR和基因芯片(產前檢測)檢測ctDNA的,但是靈敏度肯定還是大大低于NGS和ddPCR,而且隨著未來靶向藥物數量的增加,對檢測通量會有更高的要求,這或許會限制低通量檢測技術的應用。需要注意的是ddPCR、qPCR、基因芯片都只能檢測已知突變位點。


     

    ctDNA高通量測序中的主要技術:

     

    • 1 cfDNA的提取,有慮柱法(以Qiagen為主)和磁珠法兩種,如果是ctDNA檢測那么一般采用Qiagen的慮柱法,因為提取效率高,而且ctDNA測序所需的外周血量大,一般為5mL;磁珠法可以用于NIPT的檢測,因為母體中胎兒游離的DNA量比較豐富,可以達到母體外周血中cfDNA總量的10%,磁珠法的優勢是簡單快速,所需的外周血低至0.1mL。

     

    •  

    • 2 在cfDNA中篩選ctDNA,有兩種方法:第一種是多重擴增子技術,即針對要檢測的癌癥相關基因涉及相應的引物,通過引物擴增來獲得目標序列,這種方法的好處是能夠通過擴增提高檢出下限,但是多重擴增涉及到反應均一性的問題,所以一般用于幾十個目標基因的檢測;第二種方法是捕獲技術,設計探針直接從提取的cfDNA中找到ctDNA,然后通過載體將探針與ctDNA復合物拉下來,再進行分離,當前的捕獲效率一般在70%左右;捕獲技術的優點是可以設計大量的探針,目標基因可以達到上千個。

     

    •  

    • 3 當前測序公司ctDNA的測序深度在2000x到20000x左右,所采用的技術平臺主要是Illumina的Hiseq/NextSeq以及life的ion Proton,據調研反饋,Illumina技術平臺的穩定性比Life的要好一些,有公司正在籌備拿Illumina的NextSeq和life的ion Proton向CFDA申請腫瘤測序審批。


     

    ctDNA在腫瘤診治中的廣闊前景:

     

    • 1 腫瘤實時監測,ctDNA的含量與腫瘤負荷及疾病進展相關, 通過NGS對ctDNA進行定量分析,可以評估腫瘤大小變化,實現疾病實時監測。

     

    •  

    • 2 檢測腫瘤進化(耐藥),通過高測序可以檢測腫瘤的主要突變位點變化,而定點檢測手段(如ddPCR、qPCR),在評估和監測腫瘤克隆演化方面具有較大的局限性。

     

    •  

    • 3 應用于腫瘤早期篩查方面,多項研究證明ctDNA在腫瘤早期已經存在于外周血中,若與高靈敏度檢測技術結合,將有非常好的腫瘤早期篩查和殘留微病灶(MRD)檢測潛力。

     

    •  

    • 4 檢測腫瘤基因分型,有研究表明ctDNA與組織樣本中得到的檢測結果總體吻合率在80%左右,可以根據ctDNA的測序結果制定用藥策略,比如歐盟于2014年批準了阿斯利康易瑞沙(Iressa)血液ctDNA伴隨診斷,用于篩查受益人群。

     


    國內在ctDNA測序領域比較靠前的是:思路迪、世和基因、燃石生物、華大基因、貝瑞和康等。隨著二代測序技術的快速發展,技術靈敏度和特異性不斷提高,最有希望在臨床得到廣泛應用的也許會是ctDNA。


     

    4.2 CTC檢測

     

    CTC即循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)是指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循環的腫瘤細胞。CTC在患者的血液中的含量實際上是極低的,大約每100萬個血細胞(約1mL血液)中才混雜著1個腫瘤細胞,因此從血液中捕獲CTC技術難度較高。主要的分離方法和免疫治療原理十分類似,依靠具有癌細胞特異性的抗體識別癌細胞表面的抗原,從而達到捕獲癌細胞的目的。另外,CTC要比血細胞大,還可以根據體積大小用“慮篩”的方法分離。


     

    CTC的幾種分離方法:

     2.jpg

    2.jpg


     

    CTC的應用:已經完成及正在進行的大量研究顯示,CTC在臨床上具有較大的應用價值。目前,CTC在臨床上的應用主要包括以下幾個方面:

     

    • 早期篩查:研究發現,在早期腫瘤患者中,利用影像學還未發現病灶時已經可以在外周血中檢測到CTC,因此CTC可以用于腫瘤的早期診斷,2007年ASCO就將CTC納入了腫瘤標志物。在臨床上,也遇到過非常典型的案例,一受檢者利用CTC做腫瘤早期篩查,在外周血中檢出1個CTC,后又通過數字PCR技術對ctDNA進行了定量分析,結果提示該患者腫瘤與結直腸相關性較大。在隨后進行的腸鏡檢查中,在受檢者結直腸部位發現一個低分化腺瘤。

     

    •  

    • 快速療效評估——作為腫瘤生物動力學標志物:通過CTC在不同治療階段的數目變化,可輔助快速評估手術、放化療及其他治療手段的療效。

     

    •  

    • 輔助腫瘤患者分期分級:通過檢測CTC數目,輔助評估腫瘤患者的分期及分級。血液系統是腫瘤轉移的重要途徑,是否發生遠處轉移是判斷臨床分期的標準之一。近年來,CTC檢測在臨床上的應用使之成為了TNM傳統分期系統的有效補充,從而指導下一步的治療。

     

    •  

    • 判斷患者是否需要輔助化療:術后CTC數目大于閾值,建議強化術后輔助化療;CTC數目小于閾值,建議采用標準輔助化療。

     

    •  

    • 監測癌癥轉移復發風險:CTC數目上升,提示腫瘤進展,轉移復發風險增大;CTC數目下降,提示腫瘤緩解,轉移復發風險降低。

     

    •  

    • 提供預后相關的分子生物學特征:目前研究已經證實血液中檢測到的CTC可以作為乳腺癌、前列腺癌和結腸癌等腫瘤的獨立預后因素。CTC監測數目越高,提示患者預后較差。在轉移性乳腺癌患者接受系統治療之前,每7.5 ml血液中CTC計數超過5 個, 提示更短的無進展生存時間和總生存時間。在轉移性結腸癌患者中,每7.5ml血液中CTC計數超過3個,患者中位總存活期和無進展存活期都明顯縮短。

     

    •  

    • 監測耐藥情況——基于獲得連續樣本的便利性:通過檢測CTC數目變化,實時監測腫瘤藥物耐藥性的發生。

     


    CTC液態活檢應用總結:當前CTC的檢測還面臨一些挑戰,主要體現在:提高CTC的檢出率(不依賴抗體的CTC分離策略,CellCullector策略);準確地判斷具有生物學活性/功能的CTC(EPISPOT,CAM等策略);CTC細胞分離,單細胞核酸WGA操作等樣品制備的SOP和QC方案;CTC本身的異質性等。目前CTC的檢測還主要圍繞數量指標,CTC的簡單計數并不能反應腫瘤細胞內在的生物學特性,而正是這種特性是決定了不同的腫瘤細胞對治療具有不同的反應。因此,對CTC細胞的分子特性(例如單細胞測序,藥物靶向基因的表達,藥物耐受相關基因突變的檢測)的精細刻畫,將有利于充分發掘CTC在指導臨床治療的價值。


     

     

    4.3 外泌體檢測

     

    外泌體是細胞分泌出的小泡,這個小泡包含的內容非常多,有蛋白質、DNA、信使RNA以及一些非編碼RNA,是細胞之間溝通的載體。研究發現腫瘤細胞釋放的外泌體的量較大,這些外泌體與腫瘤的發生、發展、轉移以及抗藥性具有一定的相關性。


     

    外泌體攜帶的信息多樣化,其中的蛋白質和核酸,均可用于癌癥的早診、復發監測、抗藥性監測等相關方面的分析。而且外泌體在數量上多于CTC,更易富集;在形式上分泌小泡能夠有效保護核酸類物質,克服了ctDNA在血液中容易降解的問題,在臨床有較大的應用前景。但是到目前為止,仍沒有一種提取方法能同時保證外泌體的含量、純度以及生物活性。


     

    外泌體的幾種分離方法:

     

    • 離心法:這是目前外泌體提取最常用的方法,此種方法得到的外泌體量多,但是純度不足,電鏡鑒定時發現外泌體聚集成塊,由于微泡和外泌體沒有非常統一的鑒定標準,也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。

     

    •  

    • 過濾離心:過濾離心是利用不同截留相對分子質量的超濾膜離心分離外泌體。截留相對分子質量是指能自由通過某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質量。這種操作簡單、省時,不影響外泌體的生物活性,但同樣存在純度不足的問題。

     

    •  

    • 密度梯度離心法:密度梯度離心是將樣本和梯度材料一起超速離心,樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區,分為連續和不連續梯度離心法。用此種方法分離到的外泌體純度高,但是前期準備工作繁雜,耗時,量少。

     

    •  

    • 免疫磁珠法:泌體相關抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix)與外泌體共同孵育,然后分離純化。這種方法可以保證外泌體形態的完整,特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性。

     

    •  

    • 色譜法:色譜法是利用根據凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關系而對溶質進行分離的分析的方法。分離到的外泌體在電鏡下大小均一,但是需要特殊的設備,應用不廣泛。

     


    外泌體在液體活檢中的應用總結:目前有關外泌體的研究,主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內容物分析上,在臨床檢測中的應用還不成熟。對CTC、外泌體的檢測分析最終還是要落實到標志物數量、蛋白質、DNA、RNA上,蛋白和核酸的分析技術相對成熟,所以問題的關鍵還是在于如何高效的分離并純化腫瘤CTC和外泌體。

     


    五、基因測序公司(NGS)的發展方向:測序是起點而不是終點

     

    如果是基因測序產業上游的公司,產品銷售的目標客戶廣泛,橫跨科研、醫療、商檢領域,產品包括測序儀、DNA提取試劑盒、捕獲試劑盒/多重子擴增試劑盒、建庫試劑盒、上機測序試劑盒,其中測序儀、上機測序試劑盒兩者是綁定的,DNA提取試劑盒、捕獲試劑盒/多重子擴增試劑盒、建庫試劑盒是可以用第三方的產品,國內企業可以從這三個方向切入,但是試劑盒中的最關鍵的工具酶以及分離材料等都還是以進口產品為主,壁壘較高,如果能實現這兩個產品的進口替代,說明企業具有較強的技術實力。在科研和商檢領域,試劑盒的審批門檻較低,但是需要提供定制化服務;在醫療診斷領域,多基因的捕獲試劑盒/多重子擴增試劑盒不大可能通過CFDA審批(前面已經說明原因),只有通過認證的臨檢實驗室才能夠以自制試劑使用,因此這部分企業(思路迪、世和基因、燃石生物等)需要做兩手準備,籌備建設臨檢中心,向服務端布局。


     

    測序是起點而不是終點,做中游測序服務的機構,最大的市場還是在醫療診斷領域,除了通過提供服務獲得收益外,測序機構最大的潛在優勢是能夠獲得特殊患者的組織樣本,并且獲得基因數據的積累,這對于藥物開發是十分便利的條件。比如說,腫瘤患者在使用某靶向藥物后出現耐藥性,測序機構通過基因測序發現了新的耐藥位點(這是PCR、基因芯片這種檢測已知突變位點的技術所不具備的優勢),那么這個位點就是下一款靶向藥物的開發方向,并且測序機構還可以獲得患者的腫瘤組織,以此培養原代細胞株,作為藥物開發的細胞模型,這就比其他的藥物研發機構擁有更多的先發優勢。我個人看好思路迪的發展模式,以自己的測序服務為橋梁,打通患者、醫院、CRO企業,測序結果提供用藥指導,同時反過來鏈接下游藥物開發和臨床試驗,形成良好的反饋機制。

     

    案例(美國腫瘤測序公司Foundation Medicine):Foundation Medicine是一家專注于腫瘤高通量測序的商業公司,該公司專有的平臺可產生對病人的個體癌癥可操作的基因組信息,使醫生能夠在臨床實踐中優化治療,使生物制藥公司制定有針對性的癌癥療法更加有效。


    該公司以二代基因測序技術為基礎,根據癌癥基因測序結果給腫瘤患者提供精準的用藥指南。該公司的基因測序技術能夠發現導至患者罹患癌癥的基因突變,讓“個體化用藥”走進了新領域,讓醫生能夠根據患者的遺傳信息進行有針對性的癌癥治療。


    Foundation Medicine的服務需要醫生訂購,患者只需提供10余個病例組織切片或者一管幾毫升的血液。從提取腫瘤細胞的DNA到最終的報告,持續時間14-21天,其中包含了檢測出來的癌癥基因突變情況,以及針對每一種突變基因給出的用藥指導建議。


    Foundation Medicine提供兩種產品,FoundationOne和FoundationOne Heme。兩種產品均是以二代基因測序為基礎,使用的測序儀包括Illumina HiSeq 2000 system和 Life Technologies' Ion Torrent。FoundationOne檢測適用于所有實體瘤,檢測315個癌癥相關基因的編碼區域以及28個基因的內含子重排,費用為$5800。FoundationOne Heme檢測針對血液惡性疾病、淋巴瘤、白血病等,檢測405個基因的編碼區序列和31個基因的內含子重排,以及265個基因的RNA序列來檢測基因融合,費用為$7200。FoundationOne檢測的方法在2013年10月時發表在了Nature Biotechnology上。


    進行癌癥基因測序檢測需要癌癥基因的數據庫,公司因而建立了數據庫FoundationCORE。公司在2014年12月推出了瀏覽器ICE 2,該瀏覽器的一大特點是“患者匹配”功能。臨床醫生可以通過它在已有的知識庫FoundationCORE中搜索,尋找與患者腫瘤基因組類似的其他患者的信息。ICE 2的一個新的組成部分是PatientMatch,是一種利用FoundationCORE來增加FoundationOne和 FoundationOne Heme使用率的技術工具。通過PatientMatch,使用ICE 2網絡的醫生可以與在治療具有類似基因資料病人的醫生相聯系,和他們分享診斷結果合治療方案。根據公司2015年第三季度的報告,FoundationCORE已包含6萬個臨床病例信息。


    Foundation Medicine一直在努力的一個領域是醫保問題。2014年,密歇根州的大溪城重點衛生部門宣布把Foundation Medicine的癌癥基因組分析服務納入醫保范圍;Google表示谷歌公司將該公司的癌癥基因的DNA檢測服務,作為其員工福利計劃的一部分。Foundation Medicine還通過了McKesson診斷交易所和美國國家綜合癌癥網絡的認可,能夠對非小細胞肺癌進行全基因組檢測,并且收到了獨特的Z-code標識符。此外,Foundation Medicine首席財務官Jason Ryan表示,醫保范圍不僅在肺癌中逐步擴大,還將會逐步涉及到其他疾病服務。


    Foundation Medicine的營業收入主要來自兩個方面,一個是來自生物制藥公司,另一個是來自臨床診斷。2015年第三季度,來自生物制藥公司的收入為1170萬美元,與去年同期相比增長75%;來自臨床診斷的收入為1370萬美元,與去年同期相比增長40%,營收增長非常明顯。


    附:

    表1:涉及基因檢測的上市公司

    產業鏈

    公司

    主營業務

    基因測序相關業務

    全產業鏈

    華大基因

    (擬上市)

    測序儀器研發生產、提供基因檢測服務

    收購美國測序公司Complete Genomics,并將其測序儀更名為BGISEQ,提供基因檢測服務

    全產業鏈

    達安基因

    分子診斷儀器、試劑、獨立第三方實驗室

    代理Life Technologies公司Iron Proton系列儀器,申報相關試劑,提供基因檢測服務

    上游

    紫鑫藥業

    中藥材種植

    公司與中科院北京基因組研究所合作開發的中國第一款具有自主知識產權的實用型國產測序儀BIGIS系統正式問世

    上游

    千山藥機

    制藥裝備業務

    通過收購進入個體化藥物基因檢測產品開發領域,目前正在產業化

    中上游

    仟源醫藥

    藥品、兒童產品和孕婦保健品

    2014年收購杭州恩氏基因,進入基因保存領域;基因保存為未來基因測序和基因治療提供樣本和依據,為企業后續進入基因測序領域提供支持

    中下游

    迪安診斷

    獨立第三方醫學診斷服務機構

    迪安診斷2.5億元收購博圣生物,進軍優生遺傳檢測領域;同年4月8日,全資子公司杭州迪安取得了第一批腫瘤診斷與治療項目高通量基因測序技術臨床應用試點資格

    中下游

    湯臣倍健

    保健品

    子公司上海凡迪專注于基因測序服務,該公司擁有第三方獨立醫學檢驗資質,同時與湘雅醫學檢驗所達成戰略合作,主推業務為推廣NIPT和單基因遺傳病,以及個體化用藥等基因檢測服務

    中下游

    安科生物

    生物藥、化藥、中藥

    子公司中德美聯主要從事法醫DNA檢測服務,同時出售試劑盒產品。主要采用熒光定量PCR技術,儲備有高通量測序技術,未來將向醫學診斷領域延伸

    中下游

    北陸藥業

    醫藥產品的研發、生產及銷售

    子公司南京世和主要從事與癌癥用藥相關的基因檢測服務,目前北陸藥業正積極協助世和基因盡快取得基因測序試點資格

    中下游

    東富龍

    醫用凍干機及凍干系統的研發、生產、銷售

    收購伯豪生物34%股權,伯豪生物的主營業務為生物CRO技術服務業務,具體可以細分為微陣列芯片技術服務、二代測序技術服務和生物標志物技術服務

    中下游

    新開源

    生產功能性高分子PVP材料

    子公司呵爾醫療主要從事腫瘤早期診斷業務,子公司晶能生物已建立基因檢測技術平臺,能夠為客戶提供基因組學研究服務、生物信息分析服務、分子生物學技術服務等

    下游

    榮之聯

    信息技術服務提供商

    公司募集資金用于大數據的綜合運營服務系統項目的建設,該平臺初期主要是面向華大這樣的基因測序公司提供數據分析服務,今后基因測序技術成熟后會逐步面向醫院或者個人

    數據來源:廣發證券發展研究中心


    表2:國內主要測序相關企業

    分類

    公司

    綜合類
    (硬件+試劑盒+臨床應用服務)

    華大基因

    北京博奧

    深圳華因康基因技有限公司

    上海百傲

    瀚海基因

    中科紫鑫

    臨床應用服務類

    藥明康德

    諾禾致源

    貝瑞和康

    安諾優達

    上海寶藤

    上海伯豪

    解碼DNA

    達安基因

    泰州益康

    北京邁基諾

    凡迪生物

    上海天昊生物

    北京諾賽基因組研究中心有限公司

    佰美基因

    賽亞基因科技股份有限公司

    中科金美華基因檢測公司

    上海思路迪生物技術有限公司

    北京迪諾基因科技

    維達健基因技術有限公司

    南京世和基因生物技術有限公司

    上海起源生物科技有限公司

    廣州燃石生物

    銀河基因

    基因檢測在線B2C類

    genebook(華大)

    Wegene

    360基因(北京宏圖云天)

    愛基因(廈門基科)

    sungene(三博基因)

    idna(武漢益基)

    精皮士

    生物信息學分析類
    (含云計算類)

    北京基云惠康

    聚道科技

    奇云生物

    上海其明信息公司

    上海晶能

    北京華生恒業科技有限公司

    上海烈冰公司

    測序技術服務類

    上海南方基因中心

    寧波海爾施基因科技有限公司

    蘇州金唯智生物科技有限公司

    上海美吉

    北京百邁克

    武漢未來組

    上海英拜生物

    上海康成

    上海敏芯公司

    上海阿趣生物

    博苑生物

    廣州基迪奧生物

    上海歐孚

    銳博生物

    上海五色石

    中美泰和

    華康基因

    武漢生命之美

    上海銳金生物醫藥科技有限公司

    杭州沃森生物技術有限公司

    廣州賽哲生物科技有限公司

    蘇州貝斯派生物科技有限公司

    吉凱基因科技有限公司

    北京博邁德基因技術有限公司


     

     

    附:

    單位名稱 負責人
    合肥陽光醫療用品有限公司 王邦侃
    張元
    王靜
    張雪艷
    徐小弟
    安徽阜陽永恒醫學檢驗用品試劑站 馬玉虎
    馬芳
    合肥晨光醫療用品有限公司 楊艷
    史進
    合肥安美爾科技開發有限責任公司 田軍
    陳萬春
    紀宏
    開遠勝
    蚌埠航天生物科技有限公司 李凱
    孫鵬
    安徽安科醫藥集團 徐振山
    莫菲
    安徽中信生物技術有限責任公司 丁玉清
    淮南市宇華醫療有限公司 徐紅靈
    賀鳴芳
    安徽信靈檢驗醫學科技有限公司 朱德新
    王之侃
    合肥華泰醫療設備有限公司 王能國
    劉凌華
    蚌埠醫學院醫學檢驗試劑供應中心 嚴彪
    大連泛邦化工技術開發有限公司 崔永華
    溫治強
    遼寧醫化試劑研究所 呂瑩
    遼寧經貿醫化試劑經銷公司 劉恒鐵
    沈陽華美圣科醫療器械有限公司 彭華
    錦州迅達器化玻物貿有限責任公司 楊鳳云
    楊續峰
    保定市金昌古城臨床試劑有限公司 張彩艷
    張梅青
    羅彥虎
    石家莊華洋分析儀器有限公司 郝書順
    李亞玲
    石家莊康普生科技有限公司 趙作永
    張保和
    福建三明市藍波醫療器械有限公司 阮受斌
    廖士林
    廈門市波生生物技術有限公司 張火德
    三明博峰生物科技有限公司 張瑞鑒
    朱澤文
    福建福州富利達公司 徐榮根
    福州郎峰醫療器械有限公司 涂宗輝
    福建泉州博正檢驗器械有限公司 陳炳鋒
    加拿大威特曼生物科技(南京)有限公司 孫文勇
    蔡小峰
    南京求精生物技術有限公司 程建農
    江蘇姜堰市天力醫療器械有限公司 單志云
    姜堰市新康醫療器械有限公司 韓家溯
    丁克風
    張俊
    張士進
    無錫市匯生儀器試劑采購供應站 周紅
    揚州榮德醫學檢驗用品有限責任公司 吳長榮
    南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司 李春華
    葛琪
    揚州邗江紅橋富華醫用器械電子配件廠 馮太富
    馮太祥
    江蘇康健醫療用品有限公司 丁存林
    夏愛華
    江蘇海門申搏生物儀器廠 黃健
    周萍
    蘇州市宇城醫學科技有限責任公司 俞水泉
    陸勁松
    南京聯駿醫療儀器試劑有限公司 程國翔
    無錫市申瑞生物制品有限公司 盛青松
    無錫市東北塘醫化試劑經營部 孟建裕
    蘇州第壹制藥有限公司 王冠群
    沈衛亭
    波音特生物科技(南京)有限公司 李誠志
    翟皓
    上海求精生化試劑儀器有限公司 夏葉濤
    姚永珍
    余勝旺
    張四寶
    上海榮盛生物技術有限公司 余永明
    徐永玲
    呂怡洗
    闕建煒
    上海圣荷西醫療用品有限公司 宋海波
    張元偉
    雷文燦
    周雨森
    宋曉牛
    愛科來國際貿易(上海)有限公司上海聯絡處 章惠琪
    日本常光株式會社 祖輝
    上海華士信醫療器材有限公司 丁建平
    上海新波生物技術有限公司 忻衛東
    上海伊華醫學科技有限公司 張震東
    華茂豪
    李羽
    胡蕾蕾
    吳崢
    上海朗卡貿易有限公司 宣生良
    解良
    大龍醫療設備(上海)有限公司 郭雷
    江秋梅
    周健華
    上海華泰生物實業有限公司 孫文虎
    薛鋒
    吳亞林
    陳衛中
    丁嘉斌
    上海創實醫療設備有限公司 朱仁明
    薄云建
    彭曉楓
    倪紅年
    朱向陽
    上海奧普生物醫藥有限公司 黃夷人
    成先付
    朱曉俊
    張建兵
    上海復星長征醫學科學有限公司 朱耀毅
    程少熙
    李波
    陳斌
    上海豐匯醫學科技有限公司 衛君超
    江曉中
    衛東華
    張嘉純
    上海凱創生物技術有限公司 張國華
    梁德軍
    王勤
    肖海龍
    上海太陽生物技術有限公司 海青
    謝永新
    張健
    鄭黎明
    上海鴻泰生物工程有限公司 許慧驪
    張立
    商安源
    石明秋
    上海貝西企業發展有限公司 黃松民
    黃波
    上海棱光技術有限公司 陳建雄
    屠爭
    上海云大生物工程有限公司 陳桂萍
    陳建章
    卞璟琦
    嚴冰
    上海捷門生物技術合作公司 吳建華
    解建華
    上海東方順宇科技有限公司 沈軍
    沈國亮
    上海健益科技發展有限公司 王力
    蘇慧
    陳國清
    余順剛
    上海透景生命科技有限公司 姚見兒
    周愛國
    上海恩康生物科技有限公司 徐楚芹
    夏宇
    上海靈翼醫療科技有限公司 周向輝
    張關順
    上海昂佰生物醫學科技有限公司 董建國
    何宏寬
    上海藍怡科技有限公司 胡偉
    汪俊
    普萊默斯醫療器械(上海)有限公司 蔣濤
    李劍峰
    上海長島生物技術有限公司 賈永鋒
    張浩
    上海金浩科技發展有限公司 徐劍
    黃賽峰
    上海以達進出口有限公司 孫恒
    姜良和
    其昌達生物高科技(上海)有限公司 倪大正
    張慧敏
    上海度生生物技術有限公司 尹伯韜
    孫大圣
    上海玉蘭生物技術有限公司 鄭美君
    鄭美琳
    上海紐泰貿易有限公司  王素清
    周林祥
    上海北加生化試劑有限公司 劉中令
    劉柱
    劉穎驊
    上海廣茂生化制品有限公司 黃惠堅
    曹安玲
    上海開瑞實業發展有限公司 楊哲軍
    上海越升醫療器械有限公司 吳玉強
    上海捷瑞醫用試劑有限公司 張中秋
    朱慧春
    上海德記行科技發展有限公司 袁慧敏
    沈激
    朱偉東
    上海丹利檢驗設備有限公司 張賢龍
    上海市中庸檢驗設備有限公司 唐吉祥
    上海銀島經貿有限公司 王耀亭
    希森美康醫用電子(上海)有限公司 袁嘉揚
    尚曉靖
    上海金標生物科技有限公司 周中人
    周可仁
    上海威勝包裝材料有限公司 葉志偉
    曹艷萍
    上海執誠生物技術有限公司 王輝
    艾蓉
    上海申索佑福醫學診斷用品有限公司 童玉書
    盛敏哲
    上海蘭捷醫療器械有限公司 曾艷華
    上海血液生物醫藥有限責任公司 沈慧
    丁蘇鄂
    上海復旦張江生物醫藥股份有限公司 李軍
    梁俊
    楊忠發
    周明
    上海名典生物工程有限公司 邱偉
    史國強
    蘭橋醫學科技有限公司 韓濤
    李春煊
    北京鄂爾多斯泰科醫學科技有限公司 余新軍
    劉學仁
    方金榮
    盧金海
    萬華普曼生物工程有限公司 黃賓志
    劉斯
    北京健辰醫療器械有限公司 謝春玉
    吳宏光
    北京泰格科信生物科技有限公司 劉麗
    劉元
    柏定生物工程(北京)有限公司 薛汝鎮
    王冬香
    北京現代高達生物技術有限責任公司 李海波
    高菲
    北京萬泰生物藥業有限公司 里天初
    肖云
    北京科衛臨床診斷試劑有限公司 張剛
    務中勝
    北京強申醫學科技有限公司 董同義
    董海江
    左明瑞
    王開瑩
    澳斯邦生物工程有限公司 王兆強
    黃劊
    湯麗萍
    徐明
    劉梅
    德國美創公司中國辦事處 楊軍艷
    謝中孝
    北京科泰生物工程有限公司 楊志華
    陳建杰
    藍十字生物藥業(北京)有限公司 張玄
    孫巍
    北京北方生物技術研究所 潘國華
    劉剛果
    北京華大吉比愛生物技術有限公司 周錄
    王鐵峰
    北京普瑞亞科技有限公司 金菲
    金凡
    北京百龍騰科技發展有限公司 謝玉華
    劉鴻
    胡銀超
    北京利德曼生化技術有限公司 沈廣仟
    劉軍
    張海濤
    王漢勇
    北京東方化成科技開發有限公司 韓秀娟
    何文學
    北京世龍鑫遠科技開發有限公司 孫剛
    劉云鵬
    北京億博源商貿有限公司 陳志斌
    李睿
    北京億利高科生物工程技術研究所有限公司 張仲君
    張呈宇
    郭媛
    北京圣迦天潤科技發展有限公司 權昊
    北京太平洋凱泰科技發展有限公司 魏玉莊
    劉俊英
    北京金偉凱醫學生物技術有限公司 宋臨海
    陳洪坤
    王洪濤
    北京萊幫生物技術有限公司 徐文
    楊靜雯
    維潤賽潤生物試劑(北京)有限公司 張偉
    連學濤
    楊芙蓉
    楊先云
    北京首醫臨床醫學科技中心 梁宏
    蔣建勤
    吳隆芳
    李麗
    北京華葉生物工程有限公司 任彥
    柳寧
    北京熱景生物技術有限公司 林長青
    余邰華
    北京新興四寰生物技術有限公司 馮長訪
    賈鍇
    北京科美東雅生物技術有限公司 宋勝利
    李靜
    北京濱松光子技術股份有限公司 席與霖
    陳勝
    雷振
    北京榮志海達生物科技有限公司 郭志程
    郭榮程
    北京松上技術有限公司 傅宇光
    呼延軍
    梁正輝
    北京金豪制藥有限公司 曹健榮
    席蓉
    北京眾愛生醫療器械有限公司 胡志強
    文燦
    北京尚精光電技術公司 杜偉亭
    張世強
    長春博德生物技術有限責任公司 林宏杰
    呂巍堯
    吉林省長春市德隆檢驗用品經銷有限公司 李鳳義
    長春賽諾邁德醫學技術有限責任公司 孫成信
    于萍
    長春匯力生物技術有限公司 馬興鋼
    唐宇
    長春迪瑞實業有限公司 宋潔
    王明哲
    長春頤達實業有限責任公司 龐利東
    李德河
    四川奧博生物技術有限公司 王三忠
    張生波
    四川美特生物技術有限公司 高平
    四川省邁克科技有限責任公司 王太平
    謝友運
    張鵬
    成都瑞琦科技實業有限責任公司 韋德
    余健
    曾顯玲
    重慶科盛醫療器械有限公司 周成康
    重慶邁克科技公司 駱益民
    李新星
    重慶埃夫郎生物技術有限責任公司 劉海波
    河南焦作市解放免疫診斷試劑研究所 楊文保
    楊文君
    閆文杰
    鄭州安圖生物工程有限公司 楊增利
    秦耘
    鄭州中原蘭橋醫學科技有限公司 趙小慧
    鄭州博賽生物技術研究所 李華中
    邱瑞鋒
    華美生物工程公司 張濱
    陳允濤
    鄭秋生
    貝瑞特生物技術(鄭州)有限責任公司 李亞
    張燕
    河南理利生物工程有限公司 徐丘超
    張昊
    河南華美生物工程有限公司 路衛
    焦俊峰
    海南華美醫藥有限公司 張開山
    洪菲
    海南化玻科學儀器公司 陳燕珊
    深圳市安群生物工程有限公司 朱建安
    溫波
    深圳市賽爾生物技術有限公司 林連成
    蔡亞斌
    深圳市博卡生物技術有限公司 呂倉
    胡華平
    深圳市華瑞同康生物技術有限公司 周際
    謝利民
    深圳康生保生物技術有限公司 張永堅
    張小平
    深圳市科潤達生物工程有限公司 張俊卿
    楊建科
    深圳市雷諾華科技實業有限公司 王榮光
    胡亞軍
    深圳市國賽生物技術有限公司 陳明峰
    黃勃
    深圳市炬英生物科技有限公司 張偉民
    沈銘
    深圳市萃智生物工程有限公司 段文英
    張鵬
    深圳市康乃格生物技術有限公司 楊自馨
    宋亞林
    深圳市一輝龍進出口公司 胡德明
    珠海市銀科生物技術應用研究所 孫宜峰
    董玉琳
    汪泱
    余志敏
    潤和生物醫藥科技(汕頭)有限公司 方秋生
    莊健
    中山市寶駿生物工程研究所 伍海燕
    李荔生
    珠海益民生物工程制品廠 李德會
    農有俊
    江門市凱林貿易有限公司 謝至剛
    林承賢
    浩江科技有限公司 林永財
    黃華耀
    李賢貴
    珠海麗拓發展有限公司 雍學安
    彭為生
    珠海黑馬生物工程有限公司 林發青
    方玲玲
    廣東中山生物工程有限公司 陳躍龍
    王勝嵐
    珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司 何秀敏
    黃漫飛
    汪金平
    珠海浪峰生物技術有限公司 劉里仁
    文亮
    文躍
    南方醫科大學基礎生物醫學中心 王虹
    劉丹
    中山市天洋電子生物傳感器有限公司 李軍琦
    廣州市花都高爾寶生物技術有限公司 江玲
    何國彪
    華鑫科技有限公司 肖日東
    韓鐵忠
    廣州萬孚生物技術有限公司 李文美
    黃華斌
    于吉東
    陳暉
    彭賞雪
    廣州市康潤生物制品開發有限公司 曹益彬
    吳柯
    廣州市貝立醫學科技有限公司 阮宏亮
    林宇文
    德國賽多利斯廣州聯絡處 徐明
    廣州市朗道科技開發有限公司 陽世生
    潘錦紅
    潘恩棣
    林家儉
    廣州市科方醫療器械有限公司 邱河
    朱儒征
    珠海健民醫用科技有限公司 林文偉
    王千軍
    廣州環通生物科學有限公司 周小丹
    周丹丹
    廣州覽眾醫療設備有限公司 李海
    朱梅
    廣東益達醫療科技有限公司 鐘玉明
    深圳德夏科技發展有限公司 鄧克剛
    張鵬
    廣東虹業抗體科技發展有限公司 王虹
    羅超青
    深圳創強醫療器械有限公司 曹烔
    劉忠
    廣東信健醫療器械有限公司 柴維克
    濰坊三維生物工程集團有限公司 辛明霞
    劉志剛
    宿志剛
    藏世杰
    李艷民
    愛德檢測科技有限公司 李金燕
    張傳衛
    濟南金浩峰技術有限公司 李浩昌
    周理
    煙臺開發區寶威生物技術有限公司 李春荔
    徐東亮
    濟南森藍科貿公司 蔣世永
    蘇新亞
    臨沂市京華生物技術有限公司 王正連
    呂祖芳
    濟南鑫貝西生物技術有限公司 甘宜梧
    煙臺市福山半島生物技術有限公司 崔占文
    濟南杏恩生物科技有限公司 王光華
    彭陽
    濟南博萊生物技術有限公司 馬鳳英
    陳永理
    濟南蘭潔生物技術有限公司 丁銘
    青島和順醫療科技有限公司 賈瑞華
    煙臺卓越生物技術有限責任公司 蓋慶君
    劉棟
    萊陽亞東生物科技有限公司 張瑞緒
    劉洋
    煙臺高新區三得醫學科技有限公司 何峰
    鄭德春
    煙臺市芝罘區綠洲醫用試劑有限公司 呂景海
    曹海波
    山東省濰坊康華生物技術有限公司 楊致亭
    陳璇
    武建章
    桂林市華通醫用儀器有限公司 梁廣華
    陳敏
    桂林優利特醫療電子(集團)有限公司 石平
    鄭澤輝
    吳曉宇
    康曉波
    廣西柳州金偉凱醫療器械有限公司 孟慶珍
    廣西柳州海天生物技術公司 胡海濱
    南寧海鵬科技有限公司 賴仕青
    韋再
    陳波
    南寧市中衛醫療器械有限公司 張新華
    武漢中太生物技術有限公司 馬全海
    陳汪波
    武漢市中晉科技有限公司 袁普晉
    袁國良
    湖北金杏科技發展有限公司 楊柯
    龔強
    尹恒
    彭丹
    臺灣貝索企業(中國)銷售公司 李宏堂
    倪堯志
    羅明星
    長沙頤康科技開發有限公司 鄧君虎
    陳滔
    余建香
    楊海峰
    湖南省臨床檢驗中心 羅識奇
    長沙康德高科有限公司 江治
    王猛進
    長沙高新區愛威科技實業有限公司      丁建文
    劉青山
    云南金久經貿有限公司 查喬書
    寧波亞太生物技術有限責任公司 邢榮華
    江睿
    宋啟勝
    范華
    浙江拱東醫用塑料廠 鐘衛鋒
    梁同明
    張利果
    賴肖枝
    浙江夸克生物科技有限公司 商純爾
    周樂益
    楊玲玲
    朱賀
    溫州市維日康生物科技有限公司 王俊
    趙利靜
    浙江伊利康生物技術有限 王賢理
    曹春發
    杭州優仕醫療設備有限公司 王滿沖
    溫州市康泰生物科技有限公司 王賢勇
    何燕
    杭州博康生物科技有限公司 趙洪昇
    王凱
    沈超
    宋梁
    浙江東甌生物工程有限公司 崔兵
    陳紅芬
    杭州中翰盛泰科技有限公司 劉炳
    唐彥宗
    杭州博勝貿易有限公司 王鋼
    寧波中天診斷技術有限公司 鐘偉
    杭州天和微生物試劑有限公司 王欽升
    何衛
    王瑾
    包曉惠
    杭州健寶醫療器械有限公司 林自力
    黃華康
    杭州甬峰貿易有限公司 錢峰
    浙江醫療衛生用品有限公司 陳茹玉
    浙江臺州市黃巖方野醫療用品有限公司 方永丘
    顧延輝
    繆建衛
    杭州艾康生物技術有限公司 林泉
    酈勇毅
    杭州廣興醫療器械有限公司 單勤
    美利泰格診斷試劑(嘉興)有限公司 程利健
    陳向東
    寧波天潤生物藥業有限公司 臧雪濤
    狄冬根
    溫州市鹿城益民儀器試劑 有限公司 徐金榮
    支煜媚
    天津中新科炬生物制藥有限公司 劉輝
    魏健
    天津瑞愛金生物科技有限公司 劉鴻圖
    楊大偉
    天津市瑞美科學儀器有限公司 溫明
    張向陽
    天津市津東萬里化學試劑有限公司 王敬東
    天津市美德太平洋精密儀器有限公司 任峰
    李冰
    天津市賽瑞達生物工程有限公司 王波
    魏玉國
    天津市乾坤貿易有限公司 馬均彪
    甘肅科華博恩生物技術有限公司 姜濤
    中農威特生物科技股份有限公司 李克斌
    李克任
    江西特康科技有限公司 楊佳
    周洪華
    江西省南昌臨床檢驗中心 謝冬安
    南昌百特生物高新技術有限公司 練新廷
    顧邦榮
    鄧獻民
    龔海榮
    李俊峰
    江西省中炬檢驗科技有限公司 謝捷臨
    江西省贛江市臨床檢驗中心 劉水源
    江西中健醫療器械有限公司 劉建中
    黑龍江省求精醫學檢驗儀器試劑經銷有限公司 曲沖
    新疆榮盛貿易有限公司 王萍
    新疆醫通檢驗裝備有限公司 張峰
    張王彬
    太原川至生物工程有限公司 陳明
    賈春曉
    山西亞森實業有限公司 師曉斌
    王英磊
    陜西方舟生物科技有限公司 高宏
    劉平匯
    武兵
    韓東良
    陜西省臨床檢驗中心技術服務部 姚綱
    西安天隆科技有限公司 李明
    蒙武軍
    西安市福達醫療器械有限公司 屠強

     

    添加QQ:334943852 可獲得完整通訊錄

    來頂一下
    返回首頁
    返回首頁
    發表評論 共有條評論
    用戶名: 密碼:
    驗證碼: 匿名發表
    欄目更新
    欄目熱門
    幸福彩票幸福彩票app www.2000626.com | xpj539.com | www.zr499.com状态:OK | www.bole38.com | www.js9090.com | 3358332.com | www.986156.com | www.850363.com | www.550423.com | ppp335.com | 828128.com | www.625533.com | www.tlc131.com | www.3479e.com | www.00407799.com | 7720786.com | www.88332138.com | wd583.com | www.71233c.com | www.xh260.com | www.170404.com | tt7868.com | www.172747.com | www.59503.com | www.ii06788.com | www.hg0017.com | wns352.com | 8109988.com | www.367199.com | www.88550151.com | www.5405001.com | 81228q.com | www.hv277.com | www.6667758.com | www.y800011.com | www.hg7211.com | 57987.com | 040907.com | www.7736.com | 734599.com | www.305895.com | www.88jt00555.net | www.409366.com | www.939884.com | www.44488e.com | 994492.com | 3482288.com | www.yz00666.com | www.596608.com | www.j4129.com | www.0789pj.com | 11220z.com | www.499428.com | www.69688z.com | www.xpj772.com | www.tbb53.com | www.348080.com | www.503477.com | www.pj888d.com | v88136.com | www.18870002.com | www.8100887.com | www.7688688.com | www.blr0866.com | www.hg66696.com | yh03456.com | ylg85.com | www.0625014.com | www.1466v.com | www.04311253.com | www.xpj6259.com | www.4138iiii.com | www.j89cc.com | www.rcw567.com | blh1668.com | www.9064333.com | ms888g.net | bet51333.com | ylg881122.com | www.772891.com | www.vns796666.com | www.366xinxi.com | 32555bb.com | bw8989.com | ag5657.com | www.333133y.com | d8553.com | www.xpj3868.com | www.4138mmm.com | www.k2776.com | www.634331.com | 14086622.com | www.331183.com | www.lhj0678.com | 362096.com | 348088.com | www.953500.com | www.555xhtd.com | 520195.com | www.wns189.com | lhj2678.com | lc86119.com | www.865850.com | www.m.8235n.com | 31399kk.com | www.8365456.com | 9697js.com | www.571045.com | www.ya150.com | 05905t.com | www.20550979.com | 3189x.com | www.95vip8.com | www.375betbet.com | 37770355.com | www.888322.com | www.y0040.com | www.6609ii.com | www.55244477.com | www.505598.com | 38138999.com | js6051.com | www.69111n.com | www.22000151.com | www.i64602.com | www.wwwab6.com | 00998040.com | www.228543.com | www.328806.com | www.xh4477.com | www.y866644.com | www.xpj5808.com | b913388.com | hg0158.com | www.dz895.com | www.376500.com | 88f45.com | www.5206e.com | hg7211a.com | www.xpj5665.com状态:OK | www.510255.com | ag58.la | www.44166.com | www.vns3033.com | wns8828.com | www.2222yh.vip | www.505598.com | www.ms444888.com | www.980678.com | 39937.com | vns6629.com | 78856a.com | 745674.com | 6097799.com | www.447522.com | 274331.com | www.42456633.com | www.57799uu.com | 6227js.com | 28488855.com | www.95jyb2.com | 99116789.com | hg112855.com | www.560866.com | www.3126o.com | www.pj85993.com | www.6613ee.cc | 03939cc.com | www.hg25801.com | 0153uu.com | www.1166365.net | 67c53.com | www.178625.com | www.js807.com | www.142375.com | w8799.com | www.ty5555.com | 533016.com | www.501937.com | www.wh36.com | hv128.com | www.912485.com | www.9846d.com | www.df8008.com | www.a98488.com | www.33302666.com | 16688006.com | m.405776.com状态:OK | 119796.com | dewon777.com | www.188737.com | www.k2678.com | www.288385.com | js17000.com | www.670404.com | 24999cc.com | www.5146g.com | www.bet365194.com | 612189.com | www.beet.66375375.com | www.rrqp444.com | 167961.com | www.44338633.com | 0329j.com | 100242.com | 829989.com | 6441bet8.com | www.wnsr37.com | 9086m.com | www.900168.com | sbf443.com | www.t3658.com | www.bet33365c.com | 499335.com | www.541236.com | o99950.com | www.zr18803.com | 8303388.com | www.381110.com | www.209558.com | www.yh04k.com | www.0153z.com | vns996.cc | www.207216.com | www.00958c.com | www.619942.com | 378166.com | www.113607.com | www.89894e.com | www.hg0298.com | 7435m.com | 3843uu.com | m.v44419.com | www.77773709.com | www.xpj8108.com | www.4107g.com | www.875909.com | www.695601.com | www.p22111.com | 99000524.com | g93377.com | www.296135.com | bw8989.com | www.289847.com | 588zzz.cc | www.9646g.com | xj9888.com | www.994hg.com | 1239js.com | pj40688.com | www.hg2773.com | www.942669.com | j6867.com | 33550002.com | www.493326.com | www.4394b.com | www.56323.com | www.zz5002.com | 538v.com | 0359789.com | www.hg6861.com | www.0802e.com | bc9997.com状态:OK | www.050312.com | yz4888.com | www.sbf288.com | www.401278.com | www.k2341.com | www.76060g.com | www.pj5783.com | www.77774066.com | www.95679xpj.net | 850759.com | ty2299.com | www.8381j.com | www.447343.com | 30159933.com | 68818a.com | www.1xinhao.com | yh888555.com | 707747.com | www.533514.com | www.811672.com | www.538445.com | www.msc66.com | a33303.com | 5335y.com | 5214r.com | www.dhy6767.com | www.hg958.bz | 383002.net | 5757hm.com | l41668.com | hg42567.com | 35306.com | 8123678.com | www.543365.bet | www.230967.com | www.8039m.com | hg7814.com | www.xpj3398.com | f047f.com | 22880040.com | www.01819l.com | 114532.com | 00028w.com | www.99831000.com | pj81619.com | www.632051.com | www.110350.com | 44994138.com | 6668287.com | zr891.com | 59560w.com | 963499.com | www.332589.com | r8818.com | www.8313579.com | www.984688.com | www.hg99957.com | www.98am444.com | www.3983128.com | www.42422233.com | v3069.com | www.72766600.com | www.77360033.cc | 7868oo.com | 700077.com | www.9076k.com | 99799lu.com | k22555.com | yzc572.com | 66668455.com | tqdc.com | 29339177.com状态:OK | 4886f.com | hg19961.com | www.15211.com | www.bmw555222.com | ssss8010.com | tongbao094.com | hjc0.net | www.7555xpj.com | www.vip9hao.com | bet365-qqq.com | www.550417.com | www.zcwf4.com | www.8656.cc | www.888048.com | 0860n.com | www.0111js.com | www.xpj660.com | www.3938qq.com | www.6613cc.cc | www.7366005.com | www.js44088.com | 087689.com | w4110.com | www.p6011.com | i50900.com | www.xpjdc9888.com | www.z805.com | 288490.com | www.70040099.com | www.hg99616.com | 052961.com | www.577408.com | yhc28.com | 341717.com | www.771564.com | www.11170011.com | www.018461.com | v7593.com | www.8553i.com | 7979aa.net | www.k7868.com | www.968064.com | www.221894.com | 28828522.com | 8075444.com | www.59003269.com | 0138q.com | 34567i.cc | www.hg413.cc | www.66am6699.com | www.121608.com | 537002.com | 6609yyy.com | 6609d.com | 0138d.com | www.284677.com | www.pjylc1111.com | www.hg461.cc | www.6119q.com | xpj89005.com | www.xvnsr.cc | bcw9922.com | pj99998.com | 582008.com | www.r7027.com | www.www9411zz.com | 776248.com | www.24632660.com | www.358888t.com | www.94369i.com | www.73pj7.com | www.16636w.com | www.pj7278.com | 589242.com | www.476333.com | www.m64602.com | www.405178.com | www.p66126.com | 632636.com | 6906q.com | 472704.com | 7js345.com | 866596.com | www.sands806.top | www.7736i.com | 55951w.com | www.445115.com | www.yli78.com | www.wn99ii.com | www.855047.com | www.js8948.com | www.918dc07.com | 5364m.com | www.ymy3.net | www.yh8880.cc | www.yddc02.com | 589tyc.com | www.yh8426.com | 00868.com | www.053435.com | www.810msc.com | www.yh99866.com | www.9422g.com | www.8667q.com | www.9149e.com | www.710230.com | www.338017.com | www.957588.com | www.188006.com | 5207818.com | amws8899.com | heji880.com | www.685948.com | www.685932.com | www.bg8888.net | www.youfa225.com | 551614.com | 00028s.com | 234js.vip | 926567.com | www.959900666.net | 2012355.com | www.851133.com | 2146r.com | www.hg5677.info | www.114734.com | www.x33376.com | 4457e.com | www.31399p.com | www.05342055.com | www.480854.com | 80402299.com | 381msc.com | www.alpk99.com | www.624444d.com | www.833898.com | www.1466o.com | www.50080g.com | www.848966.com | www.bd292.com | www.457209.com | 3813814.com | yz2017.com | www.b5255.com | www.7848365.com | www.216531.com | 652229.com | www.8522e.com | www.75115.com | hg1020.net | www.9096633.com | www.xpj88066.com | vns3955.com | 39550033.com | v3040.com | www.91599a.com | www.07404.com | www.hg8237.com | www.sx139972.com | www.589879.com | bwin68444.cc | www.55668887.com | hycb888.com | www.wnsr262.com | www.458018.com | www.835857.com状态:OK | xpj358.com | www.6882u.com | hg0499.com | www.hlf895.com | 32555jj.com | 03132055.com | www.01819d.com | www.2355rr.com | v00888.com | www.61199.com | www.99yfa.com | www.308126.com | 778559.com | www.794288.com | 348886.com | 3136542.com | www.668424.com | aa0709.com状态:OK | www.h666333.com | 567282.com | www.mgm86801.com | 53516h.com | www.23111b.com | v649.com | www.md006.com | www.015kj.com | www.39500g.com | www.106576.com | www.272b.net | jlh04.com | 6086365.com | 7111o.com | v7668.com | vip22589.com | www9411c.com | www.45598c.com | www.wns11123.com | k88883.com | www.336631.com | www.5441w.com | dc9982.com | www.909979.com | 98201122.com | 7004a.com | 9595ee.com | a3199.com | hh629.com | 597767.com | 5254o.com | www.ab183.com | www.259681.com | www.8667x.com | www.203799.com | 18999007.com | 101330.com | www.p55444.com | c23012.com | 615488.com | xpj18788.com | www.81228i.com | www.090700000.com | www.glc66.com | www.xpj1633.com | www.55885h.com | 55777365.com | 88999666.com | amjs.tw | www.848575.com | yh8327.com | www.hlf892.com | www.138138e.com | www.v038.com | 87680s.com | www.52072j.com | 4275.ca157.com | 2268uu.com | bet3658882.com | www.502246.com | www.833553.com | www.lhj7890.com | www.xjdc48.com | www.2306i.com | www.q46559.com | www.88807j.com | www.50989f.com | www.33676.com | wh456.com | hg7673.com | dhy4747.com | www.60058655.com | www.xpj0000.com | www.yl5038.com | www.6161msc.com | www.3775d.com | www.226065.com | u72555.com | 115365.vip | 55220151.com | www.33a66.com | www.w7027.com | www.js16678.com | tt4766.com | www.3066w.com | www.915319.com | 0967ii.com | www.776365.com | www.20288n.com | www.6662wd.com | 69111e.co | 30230.com | 585299.com | www.k3322.com | www.452803.com | 304546.com | www.66657365.com | www.95999911.com | m.hg7979.com | www.3846ff.com | 857023.com | www.430msc.com | www.658zf.com | www.640063.com | 1b388.com | 8814138.com | www.y36yy.com | www.8080997.com | www.553224.com | www.hg0128.com | www.66710.cc | www.bole778877.com | bm556677.com | pj33185.com | www.h23321.com | xvns02.com | www.7837r.com | 881313.com | www.3890l.com | www.zrdc0000.com | www.zz9222.com | 222111y8.com | 774792.com | 44551314.com | www.6403w.com | www.778849.com | www.61233e.com | 3636084.com | 2546a.com | tlc4499.com | www.xpj55198.com | www.888e99.com | www.585299.com | www.zch2.com | www.710156.com | fa365f.com | pj13813.com | www.xh999000.com | www.080664.com | www.hg0056.com | www.qmfc7.com | www.hf816.com | www.36512b.com | www.d8899.net | www.295336.com | 05522004.com | www.88833js.com | www.3978w.com | bifa36536599.com | www.820778.com | hm3330.com | www.pj07222.com | www.yl6638.com | www.8007js.com | www.704126.com | www.55550333.com | 55951v.com | www.65378.com | www.335978.com | www.jin885.com | www.7240k.com | 521529.com | www.187485.com | 3337276.com | www.690265.com | js999js.com | 0241ll.com | www.ok52.com | 412329.com | 006710.com | o3065.com | www.5189111.com | 8040aaa.com | www.3404.cc | www.ylg5.cc | www.bet0114.com | www.625507.com | www.xpj88889.com | 18775e.com | s | 1666012.com | 3657703.com | 1423liang.com | 66663014.com | www.23856s.com | www.hg415.com | adffty47545641t.com | y07b.com | 345704.com | www.186604.com | www.yl6397.com | www.061626.com | www.41155f.com | www.365vip05.net | 1549ee.com | www9411bb.com | www.k666333.com | www.aa888.cc | www.8485889.com | r11112.com | www.05777n.com | www.x1330.com | www.20550531.com | www.055t.cc | www.636179.com | 67797x.com | www.hhgg65.com | www.255827.com | www.19158a.com | www.815055.com | www.wnsr967.com | 160978.com | www.0080p.com | 225ok.com | www.hr1811.com | www.sbf123.com | www.144433.com | y18001.com | 9969kk.com | www.wn68.com | www.235187.com | yh7006.cc | www.406353.com状态:OK | 28485588.com | www.80408877.com | www.hyi682.com | www.s61515.com | www.441099.com | hg9801199.com | js65c.com | 655666a.com | esb677.net | www.343699.com | www.18808888.com | 245188.com | www.jl77.vip | www.316530.com | 567271.com | 496kk.net | www.77565a.com | 992148.com | www.54844.com | zun748.com | yd626.com | www.00852qqq.com | 95662l.com | www.csgc1.com | 3796688.com | n68455.com | 02773w.com | 00330040.com | www.c6449.com | am8999.net | www.506992.com | 4186a.com | www.9010js.com | www.88djcp.com | www.28000q.com | mgm3233.com | 910585.com | pj766.com | www.868955.com | wf566.com | 95zzgw7.cc | www.566513.com | www.33382bb.com | x8165.com状态:OK | www.3189g.com | 81138r.com | k4408.com | 6219888.com | www.4912b.com | 496ll.net | www.3668y.com | www.md6lc8.com | long113.com | www.488929.com | www.hy384.com | www.912063.com | yrmt9.com | www.tlc0087.com | www.80811b.com | www.amwnsrylc.com | www.286276.com | www.h1211.com | 6261n.com | www.61069999.com | www.msc-msc.com | 3333sands.com | r7868.com | www.3522y.com | cb555.cc | www.760320.com | j89qq.com | www.315692.com | v7997.com | www.366428.com | 91789e.com | www.531089.com | www.hg19984.com | 8455i.com | www.ambjlt.com | 8494j.com | 11wnsr.com | www.380833.com | p55522.com | www.54688aa.com | www.lczg9.com | hycb888.com | www.hddt.82800.com | www.8886696.com | www.67r6.com | www.348400.com | 468094.com状态:OK | www.32555kk.com | www.hg3733.com | ff5552.com | 31399c.com | www.www9411bb.com | s8s66o.com | yh538mmm.com | www.296418.com | www.611666k.com | pj5657.com | www.112779.com | hg6779.com | p66977.com | www.496r.net | www.320662.com | v77l.com | www.6225s.com | www.140js.com | www.455745.com | www.36590111.com | 2528pp.com | www.93377n.com | www.229958.com | www.6534a.com | www.hg7901.com | www.vns6078.com | www.869809.com | www.ab365.cc | hg7861.com | rrr5002.com | www.239828.com | 8hga.com | c37288.com | www.44488p.com | dc9099.com | www.590859.com | www.853758.com | www.767775.com | www.621345.com | js90488.com | www.5219b.com | www.777444n.com | dhy8666.com | www.2767uu.com | ra8118.com | hg7695.com | www.ks338.com | www.181885555.com | www.js0008.com | www.83993s.com | 226600j.com | 6623i.com | www.v488.tv | www.812830.com | 9823444.com | hg87458.com | www.68666c.com | 52688o.com | 7276t.com | m.13901b.com | www.1666888.cc | wjpy6.com | www.wd0111.com | www.01517766.com | www.810603.com | hg9975.net | 6834v.com | www.68666u.com | www.7826267.com | www.340083.com | 679033.com | www.lj559.com | 30858b.com | www.77ms888.com | 33555002.com | www.270667.com | www.659589.com | www.pj97168.com | 3668722.com | k8022.com | kkk801.com | www.a4808.com | www.979233.com | hg36777.com | www.xpj2568.com | www.778306.com | hg50838.com | www.longdu13.com | www.88128u.com | www.11gpc.com | hg270.com | www.xin999888.com | 6491i.com | www.220454.com | www.am2226.com | www.777444y8.com | www.586198.com | 7534999.com | 418617.com | hg1733.com | 736903.com | www.228864.com | www.vns8918.com | www.hg9960.com | 31322a.com | 994191.com | www.538445.com | 959900444.com | mgm8085.com | www.k6636.com | www.760726.com | o23023.com | www.hg33444.com | www.dafa888.com | www.2938423.com | www.240165.com | www.js18499.com | www.cai003.vip | sbd5555.net | www.vns3234.com | www.hg0088.deals | www.bjl916.com | www.095868.com | m.hg7979.com | www.1148b.com | hv218.com | www.95990381.com | www.5002mmm.com | blr1989.com | 19933c.com | www.x41668.com | www.779635.com | www.495344.com | www.5181900.com | www.js403.com | www.893380.com | www.579612.com | 0241x.com | www.615959.com | www.k8md21.com | www.46253.com | www.203799.com | www.388785.com | www.3008553.com | www.889489.com | www.290961.com | www.58488.com | www.70203d.cc | www.bet305c.com | e45638.com | www.55268uu.com | 3a455.com | 00022551.com | www.7036cc.com | www.39500l.com | hg7834.com | www.22211105.com | www.sd58qp.com | www.k38777.com | www.27877p.com | www.aw6789.com | www.youle098.com | 8867m.com | www.xpj29666.com | 3950c.com | 20455.com | www.4625y.com | js91999.com | www.860083.com | www.21365xx.com | www.8167o.com | www.hgw4333.com | www.vns993.cc | www.y68866.com | www.hg0736.com | www.vns8897.com | www.wf2233.com | www.f1624.com | www.v1878.com | s8s08.me | 28489966.com | www.4212h.com | 328365365.net | dzj005.com | www.jm49.com | hg131g.com | x8126.com | www.44074.com | 136545.com | www.bd303.com | www.570041.com | 00042233.com | www.vv707.com | www.998924.com | ha99888.com | 6787755.com | www.ac9911.com | 55951v.com | www.jsdc766.com | www.330715.com | 0138r.cc状态:OK | www.585030.com | www.80767v.com | www.067941.com | www.tyc1738.com | 6150.com | 289338.com | www.836666s.com | www.454608.com | www.7057788.com | www.xw6655.com | www.sbd33.net | www.lhj1123.com | www.33302a6.com | 30301.cc | 55556609.com | www.5xci.com | 0153cc.com | 5454ffff.com | 59609.com | www.526269.com | www.809031.com | www.19988803.com | www.293610.com | www.ylg122.com | g34034.com | www.ms8803.com | www.43818f.com | 7004f.com | js06656.com | ag3917.com | www.1770tt.com | www.bm1211.vip | www.kb8881.com | xhg044.com | www.5004gg.com | www.6000hd.com | 2vn3.com | 343881.com | www.151880.com | 3559g.com | j93377.com | k8md16.com | www.55519d.com | hg3301.com | www.36590666.com | www.12218d.com | www.791397.com | www.792025.com | 71696.com | heji1008.com | 7773020.com | hg0770.com | 77365d.com | www.91136k.com | www.555446.com | zzwin168.com | www.428048.com | jzplay168.net | www.4167i.com | www.911.hk | 73386666.com | www.06658.com | www.504898.com | mgm5848.com | www.405776.com | b9994.com | 9702dd.com | www.501347.com | 4116a.cn | 4261133.com | 135770.com | www.846663.com | www.1555ac.com | amjsccc.com | www.448991.com | 2938423.com | www.hg200200.com | www.318008.com | www.bt278.com | www.83008l.com | www.069963.com | 5876832.com | www.82533666.com | www.youfa260.com | hg00853.com | www.900122.com | 020802.com | k38888.com | www.479308.com | www.9411p.com | www.41518y.com | www.422850.com | www.vns6890.com | www.434599.com | www.519250.com | www.xb8899.com | ty287.com | www.b36509.com | hm753.com | www.mgm3909.com | www.w98478.com | 88832055.com | 8040vvv.com | www.849880.com | www.pj8445.com | www.52072z.com | 776776e.com状态:OK | www.678929.wang | zb0139.com | 654883.com | www.83033c.com | www.170639.com | 6301888.com | rb9990.com | www.pj90688.com | www.c760.vip | amdwc7.com | www.b3788.com | pu9888.com | www.w8733.com | 56686799.com | www.8668y.com | www.10852b.com | gg.3413399.com | www.wn99ss.com | hf5599.com | www.6465v.com | www.18690a.com | 62222b.com状态:OK | www.h99111.com | www.am3365.com | rich233.com | www.50026a.com | hj4440.com | www.556939.com | 8040xxx.com | a7837.com | 790766.com | www.pj1021.com | www.igcp6.com | cx9873.com | 38200o.com | hgg3737.com | www.q4364.com | www.69666123.com | www.66pj8.cc | www.933509.com | app6868.com | www.hg5155.com | www.15amhg.com | 97066001.com | 9293874.com | www.63355xpj.com | www.585hc.com | www.longdu05.com | www.21365ll.com | cs553.com | www.83377k.com | 5534777.com | 5287558.com | www.218251.com | www.yh8374.com | www.6718.cc | 550897.com | am88800.com | ysb36.com | www.353308.com | www.hg118444.com | 28483388.com | www.yinhehhh.com | ylg05.com | www.xpj57988.com | www.28277aa.com | www.pj3703.com | www.rcw456.com | rb33333.com | www.la0666.com | www.610626.com | www.5003dd.com | www.zhcp333.com | js345a.com | 0000bw.com | b23012.com | www.44czt.com | www.15511009.com | 006087.com | 066602.com | www.vns01666.com | www.644193.com | js13000.com | www.56262.com | www.dzj444.com | www.596709.com | 7892906.com | www.0010013.com | 698088.com | www.pj1330.com | 99950004.com | www.5003lll.com | www.030949.com | vns89999.com | 8234769.com | www.p38388.com | www.033253.com | ee9068.com | www.038839.com | 8099789.com | www.hg226.com | www.276260.com | www.6403hh.com | www.ylgv7.com | www.780979.com | www.566065.com | www.00226609.com | 3435888.com | www.2884237.com | www.504638.com | 513757.com | www.xpj68.com | amxhtd5.com | www.pp3737.com | 11993955.com | 89356o.com | www.906609.com | tyc3728.com | www.hr5566.com | www.3178f.com | js5988.com | www.34567c.cc | www.343509.com | www.345941.com | www.488018.com | www.1469p.com | www.jsbet008.com | 888884u.com | www.79696.com | www.chai95990.com | www.hg0096.com | 6js333.com | www.f045f.com | www.999365.co | www.0006508.com | 563466.com | www.818098.com | www-2296.com | www.81228y.com | www.701402.com | www.776776n.com | www.588310.com | www.pj77066.com | www.196037.com | www.24338k.com | www.009ac.com | 00789i.com | www.50074b.com | www.55244444.com | www.9971003.com | 59963d.com | www.pj7787.com | ii7837.com | www.pj80888.com | www.789154.com | www.65757q.com | h3678.com | www.vns077.com | www.bet365772.com | www.7276tt.com | www.870280.com | www.005517.com | 608069.com | www.8886676.com | www.00772.com | j9858.com | ssss8034.com | 63080.com | yahu14.com | www.3330ylg.com | www.blg588.com | www.4437aaaa.com | www.nb7400.com | www.81849c.com | www.700148.com | www.55995004.com | 18365b.com | www.yddc550.com | www.39amhg.com | www.js6676.com | hg168z.com | www.88938h.com | www.v997799.com | www.r373.com | 3412244.com | www.jl00.vip | 7276qq.com | www.77117076.com | 9800024.com | www.9906132.com | www.00958j.com | www.kj333888.com | www.ms555111.net | www.22dwj.com | www.hg3394.com | www.517844.com | www.vip2xpj.com | ca185.com | www.pj8059.com | abdwc78.com | www.44006609.com | 16600007.com | www.js1185.com | yahu780.com | 83377y.com | 112899.com | 13608l.com | www.663224.com | www.12741f.com | www.zr982.com | 2846y.com | x88997.com | www.798344.com | www.xb788.com | www.gei30.com | xpj66630.com | 918aak.com | www.pj9178.com | 77sb.com | www.vip66625.com | sx8889.com | www.0151g.com | www.hg179u.com | www.1516pp.com | a758m.com | 766848.com | 02773b.com | www.138msc.com | rb624.com | www.rrle6.com | www.9844002.com | 5213579.com | 53516i.com | www.811091.com | 059871.com | www.y484344271.com | kkk5002.com | www.240340.com | 6664ylg.com | vip7xpj.com | www.99094u.com | y7887.com | www.695899.com | www.55193.com | 99111qq.com | www.44yh44.com | 974336.com | www.wn99j.com | www.7045l.com | www.68666p.com | 66997720.com | www.bett365.cc | www.yh0612.net | www.267051.com | pj3508.com | www.c9332.com | 7003366.com | www.66653i.com | www.zr697.com | www.131052.com | 7736i.com | 3555116.com | www.w4110.com | 0138n.cc状态:OK | www.000xy8.com | 44889y.com | www.150822.com | www.x8102.com | 15577004.com | 77660151.com | 33566gg.com | www.32126d.net | www.amxhtd66.com | www.3416d.com | www.pj89913.com | ljw999.co | www.js20333.bet | bmw222222.com | hg767x.com | j8553.com | www.yh98598.com | www.yh355.com | www.111btt.com | 0805o.com | www.hr455.com | www.k77666.com | www.90622023.com | www.348458.com | www.y36f.com | www.50026v.com | 5189979.com | vgs668.com | www.vns066.com | www.364358.com | www.44234.com | www.i55668.com | 588-5.cc | www.1908xpj.com | www.hg112855.com | 1423wei.com | www.u180888.com | www.984702.com | www.hg3888.net | www.7484o.com | www.20550979.com | www.033565.com | www.68169b.com | 684669.com | www.927699.com | www.33787e.com | 677127.com | vns9218.com | www.618534.com | www.xj666s.com | www.022hg.com | www.780875.com | js.am | www.497588.com | www.422442.com | www.5031666.com | www.820289.com | 812989.com | www.wnsr43.com | k24074.com | www.00787.cc状态:OK | www.12455o.com | 4167j.com | 73335359.com | www.v56844.com | 78556655.com | www.1114338.com | www.hg73657.com | www.x1318.com | www.17727qq.com | www.391380.com | 36677a.com | www.he0044.com | www.2000566.com | js388999.com | 125603.com | www.hjdc2005.com | www.975598.com | 95664444jj.com | 9959kk.com | y966.com | boma0190.com | www.y36uu.com | www.4018w.com | 09382055.com | www.144.mn | www.65471188.com | 00829s.com | www.0625019.com | www.e0151.com | vns15711.com | 99291a.com | 163888v.com | www.g2261.com | 4778.com | www.340499.com | www.0004sc.com | www.48588g.com | www.m2665.com | www.7909888.com | pj89888.com状态:OK | www.3479k.com | www.xpj8760.com | www.3122vip2.com | www.35442333.com | lehu578.com | www.178795.com | www.68868w.com | www.779401.com | www.55268oo.com | www.383003.net | hg5037.com | www.114339.com | www.262306.com | www.56720.com | xpj33599.com | www.692065.com | www.v578.com | www.hm1117.com | 37770538.com | 45598i.com | www.393390.com | www.25959a.com | www.a99138.com | r2665.com | www.www-959111.com | p8867.com | www.399049.com | w8698.com | www.3650035.com | www.y18bb.com | hg4498.com | 7368169.com | www.55615h.com | www.4138zzzz.com | www.500285.com | www.660464.com | 921928.com | www.wnsr0055.com | 0080n.com | qile219.com | www.6635xx.com | www.yzc575.com | xpj5345.com | 77664066.com | www.2247111.com | www.0055wd.com | www.66198.cc | vns9795.com | 0xinhao.com | www.766848.com | 310041.com | www.5004m.com | www.28383.com | www.313703.com | 30155544.com | www.408699.com | www.0343k.com | www.58pj8.cc | bodog0020.com | www.20088hg.com | www.802566.com | www.df0818.com | 008439.com | x24074.com | 188ddd.com | www.005589.com | 84898e.com | www.3890r.com | www.6609yy.com | dmgbet4.com | www.12706.com | www.630404.com | yf1144.com | www.hg9812.com | 5550066.com | www.3144am.com | www.pj77022.com | www.05833.com | buyu059.com | www.55440040.com | 1423ss.com | www.135edf.com | www.137098.com | www.y7875.com | www.663948.com | 055333d.com | www.361551.com | www.45565.cc | yh18838.com | 00403399.com | www.hg118.com | www.b33958.com | www.3659070.com | www.789030.com | www.q9927.com | www.11160055.com | www.216yh.com | www.28482255.com | www.ym266.com | www.00829x.com | www.mgm11288.com | 62289d.com | www.223456u.com | www.hg97933.com | 08sa36.com | www.hg18518.com | www.5550077.com | www.00773f.com | www.a3a111.cc | www.hg7896.com | 16699902.com | www.j99888.com | hg3103.com | j84888.com | www.94911.cc | hg85889.com | wxc411.com | 33928a08.com | lhj8123.com | zr125.com | www.8181msc.com | www.3189n.com | pjpj0021.com | www.33678ff.com | www.613332.com | www.k38555.com | www.hwx66.com | www.429258.com | 83365e.com | www.566493.com | 80056.com | 88665002.com | www.022gz.cc | www.31399qz.com | www.817886.com | www.530877.com | 027667.com | 66686w.com | www.m98777.com | www.495.cc | 136pj.com | www.442770.com | jing559.com | www.y99999.com | www.189493.com | www.111122r.com | www.hg77188.com | www.709886.com | www.026319.com | www.xpj3689.com | bet5180.com | www.456369.net | 78688522.com | 717xpj.com | www.hm5688.com | 059860.com | xjgw444.com状态:OK | www.19880v.com | www.a4808.com | 33318t.com | www.3630a.com | www.sb1102.com | 03yh76.com | 66011111.com | www.a1a777.net | www.3189t.com | www.b334455.com | www.3a331.com | www.aa9702.com | www.530916.com | www.648689.com | www.017488.com | 4111t.com | 1365bet.org | www.vns85222.com | www.h13666.com | whh5500.com | www.0088hg5.com | www.www-4759.com | www.hg00698.com | www.99jta.com | www.97077k.com | 9599004.net | vns321.com | www.qhc03.com | www.hg90086.com | jm234.com | www.dhy1114.com | www.23488p.com | wns66123.com | www.987426.com | js9900ok.com | 38549999.com | www.dj138138.com | www.665888p.com | www.295239.com | www.308876.com | www.2418t.com | www.vns5622.com | 764608.com | www.9086w.com | v3021.com | www.a3199.com | www.vd00.com | du0005.com | n2959.com | www.590257.com | www.355246.com | www.37799b.com | www.aobomg.com | 6543456.com | www.7776358.com | www.77727720.com | j7764.com | www.715699.com | www.yl1981.com | www.ylg661.com | www.hg19985.com | www.0860g.com | www.pj71966.com | ooo5002.com | www.546868.com | www.v2222.tv | www.7897706.com | www.139974.com | www.790808.com | 2000052.com | bd3088.com | xxxx9012.com | www.tt1682.com | www.6147645.com | 203738.com | www.51331h.com | 0855111.com | wd9033.com | 3702088.com | www.333133x.com | www.53516q.com | 847004.com | www.102386.com | www.v6965.com | www.312090.com | www.555934.com | www.82894d.com | www.j1516.com | xpj0801.com | 902025.com | q30226.com | www.478968.com | s3099.com | 3482.ca837.com | 290856.com | 820062.com | w7365.com | www.950665.com | www.400888j.com | www.y9559.com | www.whao88.com | www.6678578.com | www.yh622vip.com | www.506902.com | www.107630.com | www.11227136.com | www.303875.com | 77yli.com | www.zrdc3333.com | www.6137m.com | 8706pj.com | d4129.com | 95990011.com | www.wi818.com | pj1310.com | www.2js.com | www.270667.com | www.6403ss.com | www.ra2233.com | www.135638.com | www.927670.com | www.5003zzz.com | 386099.com | www.h1879.com | www.bai355.com | www.vns4808.com | yh46999.com | www.xh815.com | www.29699.com | www.tyc7863.com | www.757747.com | ule346.com | www.68682d.com | www.101022.com | y3488.com | www.233776.com | www.25688d.com | 567899h.com | 810771.com | www.30555o.com | www.9818j.cc | 400888t.com | www.1469u.com | 3657hd.com | www.5091f.com | 139003.com | www.4102e.com | www.36512a.com | www.976115.com | wns44123.com | hg771122.com | www.k860.com | www.848665.com | www.a7589.com | www.cn0013.com | www.rb8877.com | yl9888.com | www.w68.22775454.com | 563096.com | www.055975.com | www.93377s.com | www.90455.com | 4531w.com | www.653898.com | ylhg0808.com | www.06789e.com | zz3709.com状态:OK | www.df8vv.com | www.308759.com | www.329477.com | www.520364.com | www.e28111.com | www.678471.com | www-xx33.com | www.56520j.com | www.779955.net | www.hai3000.com | www.163248.com | www.hb598.cc | 2306f.com | www.591505.com | www.365530.cc | www.055890.com | www.9411e.com | www.447315.com | 88885309.com | www.z72555.com | www.3650092.com | 88993b.com | y35cc.com | www.393bet.com | www.423689.com | www.vnsr1668.com | www.550pj.com | www.953567.com | dhy445.com | www.3709885.com | j3678.com | www.y9887.com | 34034f.com | www.187380.com | www.bt236.com | www.f333266.com | 392223.com | www.566526.com | www.3301844.com | www.3036797.com | hg21772.com | hg17788.com | www.30987o.com | 89777j.com | www.05142004.com | www.rb5588.com | bet068.com | www.340477.com | www.t6609.com | 2767u.com | h553066.com | www.28443333.com | www.33112h.com | www.00668040.com | www.234886r.com | www.586048.com | www.113507.com | www.56bet365.cc | 0151i.com | www.hh859.com | 55615x.com | www.878841.com | www.zb966.com | www.bc567.vip | www.518454.com | 5858365.com | www.044833.com | www.300388.com | www.46250077.com | 89897909.com | www.31365zzz.com | bbo3.com | www.hg001111.com | www.04582004.com | www.amxj5511.com | bet365605.com | www.ag4242a.com | www.bet1677.com | www.jsdc9888.com | www.866808.com | www.3650093.com | 185xpj.com | www.5556358.com | www.h7868.com | a2899.com | www.528802.com | 01266a.com | www.xpj20888.com | www.y1177.cc | hg5675.com | kkk8633.com | www.2634.com | www.89777x.com | www.0040d.com | 040410.com | 88528mm.com状态:OK | 973000.com | www.lu126.com | 1h456.com | xpj6099.com | 5207800.com | www.24836536.com | www.37770955.com | www.hg123888.com | j8852.com | 0788yh.com | vn535.com | www.855pj.com | www.1358003.com | www.vns0609.com | 27877o.com | 36949222.com | 755988.com | www.330865.com | www.ag3131g.com | www.30151188.com | www.669470.com | www.5860a.com | www.405765.com | www.u77929.com | www.8040ggg.com | www.amxpj678.com | www.3559g.com | 278365365.com | www.121ag88.com | www.77ff940.com | www.7733y8.com | lhj7891.com | 039689.com | zb0139.com | www.865820.com | www.b9599.com | 3421o.com | 180733.com | 905996.com | 980375.com | www.54400h.com | www.abdwc852.com | www.504178.com | www.xj0012.com | hg1259.com | www.567bifa.com | www.ihg5511.com | 5002ddd.com | 34545k.com | www.13990665.com | 900422.com | www.abdwc55.com | www.55676c.com | www.33885002.com | www.775096.com | www.851340.com | www.407714.com | 1666012.com | www.25683.com | g678929.com | xpj8867.com | www.24999dd.com | www.272862.com | g2232.com | www.50064f.com | www.272758.com | www.123412.cc | www.785752.com | www.259185.com | 11a33.com | www.901175.com | www.kim111.com | www.98707t.com | xl1818.com |